干货分享 | 代谢组样本收集指南

样本的准备是开始代谢组项目的第一步，也是决定一个项目能否成功的最关键环节。样本取样及时，合理，后续实验数据有代表性，挖掘数据时更有针对性。

科学基础研究中，常见的样本类型包括细胞样本，动物组织样本，血液样本，体液样本，植物样本等。下面从代谢组样本送样量、不同样本类型制备流程来进行详细阐述，帮助老师顺利开展实验~~~

一、代谢组建议送样量

1.1 非靶向代谢组建议送样量

注意：1、样本中不能含高盐，不能含去垢剂，如SDS、Triton、NP-40等。PBS等冲洗样本应尽量去除buffer残留。

2、收集后尽快放进液氮里面速冻，尽快放置于-80 ℃。

3、液体样本用1.5/2 mL进口离心管保存，液体样本不可装太满，一般不超过3/4，因结冰后会把盖子顶开导致样本泄露和污染。含有有机试剂时加封口膜密封好，样本管有垫圈，每个样本单独一个密封袋。

1.2 靶向代谢组建议送样量

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二、代谢组样本准备指南

2.1  血清/血清样本

2.1.1 血清和血浆我该选哪种？

全血的稳定性差，存在异质性，所以一般检测中避免使用全血而选用血浆或血清。血浆是在全血中加入抗凝剂（肝素、柠檬酸盐、EDTA）防止纤维蛋白原凝固，然后通过离心分离出的上清液。在抗凝剂的选择上，柠檬酸盐为内源性代谢物，一般建议选用肝素或者肝素钠作为抗凝剂。血清是不加抗凝剂的全血在室温下放置30-60 min自然凝固后，通过离心分离出的上清液，期间一些较不稳定的代谢物可能会发生酶转化和降解，如黄嘌呤、牛磺酸、谷氨酰胺、含硫氨基酸、苏糖酸、麦芽糖、甘油三酯等代谢物，但血栓素 B2只存在血清中，且血清中的精氨酸，丝氨酸、苯丙氨酸等氨基酸以及磷脂的含量都比血浆相对要高，应根据具体实验需求进行选择，如果不关注上述血清和血浆的差异的话血清和血浆都可。

2.1.2 血浆

1）用含有肝素钠的5 mL采血管（根据具体实验具体选择）采集血液，采血后立即轻轻颠倒混匀采血管5-10次，以确保抗凝剂发挥作用;

2）采血后需在30 min内尽快离心分离出血浆(若不能尽快离心，采集的血液需放在4 ℃冰箱保存，并必须在4 h内完成离心及分装），4 ℃条件下3000 rpm离心10 -15 min，吸取适量上清液（即血浆）置于合适的已编号的EP管中;

3）如此重复分装成多管血清以避免反复冻融，尽快将血浆保存于-80 ℃冰箱中。

注意事项：

1.血浆参考产率≈50%，例如1 mL全血大约能得0.5 mL血浆；

2.建议优先选择肝素钠抗凝管（真空采血管帽盖为绿色）或者EDTA抗凝管（真空采血管帽盖为紫色）；如果需要同时开展转录组相关检测，建议优先选择EDTA抗凝管（真空采血管帽盖为紫色）。

2.1.3 血清

1）用不含抗凝剂的样本收集管采集血样，或将采好血样的采血管室温静置（注意：不能振摇采血管）；

2）静置30-60 min使其凝结后，再将采血管放入冷冻离心机内，4 ℃条件下3000 rpm，离心10-15 min，吸取上清液（即血清）分装于合适的已编号的 EP管中；

3）如此重复分装成多管血清以避免反复冻融，尽快将血清保存于-80 ℃冰箱中。

注：血清参考产率≈30%~50%，例如1 mL全血大约能得0.3~0.5 mL血清

注意事项：

1）检查血浆或血清是否有溶血，溶血可以引起苯丙氨酸、鸟氨酸、柠檬酸、琥珀酸、磷脂以及鞘脂等多种代谢物的改变。下图前两种状态可以接受，且不同样本间要溶血状态一致。

2）取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样；

3）全血样本加与不加抗凝剂处理后如下图展示：

4）样本收集完成之后尽快保存于-80 ℃，不可长期置于4 ℃（不超过48 h）或-20 ℃（不超过7天）。

2.2  细胞样本

2.2.1 贴壁细胞

方法1（刮细胞法，建议首选）

1）种细胞时候组内准备7-8个重复，一般认为一起铺板和做同样处理的样本平行性较好，多出来的那个样本细胞计数的值来代表该组细胞数目;

2）从培养箱中取出那个用于计数的细胞样本，去除培养基后用PBS洗一遍，去除PBS，之后加胰蛋白酶消化后计数，得到细胞数目，接下来开始处理正式实验用的样本;

3）去除培养基，加PBS洗2-3遍后彻底去除PBS;

4）加入1 mL预冷的LC-MS级别的甲醇/乙腈/水(2:2:1, v/v/v, 代谢组)或甲醇（脂质组）,  快速用细胞刮将细胞刮下来，收集到进口离心管中，加封口膜密封好，送样前置于-80 °C保存;

方法2（酶消化法）

1）去除细胞培养基，迅速用预冷的 PBS缓冲液清洗细胞，清洗两次，然后离心去除上清；

2）加入胰酶，消化至部分细胞呈球状；然后加入培养基，轻轻晃动，使培养基浸润细胞终止消化，吸出剩余培养基；加入PBS吹打，悬浮细胞；

3)快速计数(一般认为一起铺板和做同样处理的细胞平行性较好，组内挑选1-2个用来计数即可，不用每个样本都计数)，取1*107个细胞所需要的体积；

4)除去上清，将细胞放入液氮中速冻后置于-80°C暂存。

2.2.2 悬浮细胞

1)  一般认为一起铺板和做同样处理的细胞平行性较好，组内挑选1-2个来计数即可，不用每个样本都计数；

2)  根据得到的细胞数目对细胞培养悬液体积进行折算，保证每组细胞数目至少都在10^7左右，如：A组和B组计数的结果分别在1.3×10^7和2.6×10^7，那么细胞培养悬液A组可以全部保留，B组只需要取一半即可。离心去除培养基， PBS洗2-3遍后离心去除PBS，液氮速冻后置于-80 °C暂存。

注意事项：为保证实验结果的可比性和可靠性，请务必进行细胞计数。少数体积特别小的细胞应至少保证在组间和组内平行的情况下细胞沉淀体积在20 μL以上，此时不需要严格按照10^7。

2.3  动物组织

1）根据具体实验设计准确切除所需组织，迅速剥去非必需的脂肪和结缔组织等 非研究所需的组织类型，然后分割成小块；

2）用预冷的PBS缓冲液或生理盐水清洗干净，以去除血液残留和污物；

3）用干净的无尘吸水纸吸干水分，将组织样本装入冻存管；

4）管子上做好标记后迅速放入液氮中冷冻处理15 min，于-80℃下保存。

2.4  尿液

1） 晨起中段尿（临床）或晨间1小时尿（动物）新鲜样本直接分装到离心管中；

2） 添加质量体积为0.5/1000（w/v）的叠氮化钠（若叠氮化钠获取困难可用1000 rpm 4 ℃离心5分钟，0.22 μm滤膜过滤方法代替）；

3） 处理完后，管子上做好标记，于-80 ℃下保存。

注意事项：叠氮化钠的作用是防腐杀菌，有毒，使用时请万分小心。

2.5  粪便或肠道内容物

2.5.1 人的粪便采集（参考文献1）

1. 采集前先排尿，将粪便于清洁干燥的容器中，采样时间为早上和中午较好；

2. 取样，共有3种，可自行选择：

1) 中段内部取样（参考文献 2）：用无菌小勺、手术刀或粪便取样器采集粪便中段内部的粪便样本。同时采集多份分装，液氮速冻后-80 ℃保存。

2) 多点取样分装（参考临床粪便镜检的方式以及参考文献3）：用无菌小勺、手术刀或粪便取样器在粪便的多个不同部位采集粪便样本，然后将不同部位采集的样本混合，作为1份分析样本。同时采集多份分装。液氮速冻后-80 ℃保存。

3)【推荐】人工混合取样（参考文献 3）：收集整个粪便，采用无菌小勺、手术刀或粪便取样器等工具，将全部粪便混合均匀，然后分装为多份。分装和称重：每管标记好的2 mL进口无菌离心管装量1 mL左右的体积，称重记录，采集足量达到样本量要求。可每例样本准备多管备份。液氮速冻后-80 ℃保存。

2.5.2 大小鼠的粪便采集

1. 大鼠或小鼠置于代谢笼中饲养，一笼一只，粪便样本不能有尿液污染。

2. 取样有两种方式，请自行参考和选择。具体如下：

1)【推荐】采用逼迫法或按摩腹部法应激排便，直接将粪便样本采集在无菌管中。同一只鼠收集的样本混合均匀后分装到2 mL进口无菌离心管，称重记录，采集量达到样本量要求。每个样本取多管备份。液氮速冻后-80 ℃保存。

2)  直接收集排在笼子里的粪便，去掉外层污染物，粪便样本暴露在环境中的时间不宜过长，超过1小时建议重新收集。同一只鼠收集的样本混合均匀后分装到2 mL进口无菌离心管。每管装量1 mL左右的体积，称重记录，采集足量达到样本量要求。每个样本取多管备份。液氮速冻后-80 ℃保存。

2.5.3 大小鼠肠道内容物采集

1．处死实验对象，用无菌解剖刀在无菌手术台上剖开腹腔，取出整个肠道。

2．取样：切取所需肠段的内容物，用无菌手术刀刮取内容物，混合均匀。

3．分装：采用2 mL进口无菌离心管，称重记录，采集足量达到样本量要求，每个样本可取多管备份。液氮速冻后-80 ℃保存。

参考文献

[1] Collection media and delayed freezing effects on microbial composition of human stool [J]. Microbiome, 2015, 3(1):33.
[2] Nechvatal J M , Ram J L , Basson M D , et al. Fecal collection, ambient preservation, and DNA  extraction for PCR amplification of bacterial and human markers from human feces[J]. Journal of Microbiological Methods, 2008, 72(2):124-132.
[3] Marchesi, Roberto J. Optimized Sample Handling Strategy for Metabolic Profiling of Human Feces [J]. Analytical Chemistry, 2016, 88(9):4661-4668.

2.6  微生物样本

2.6.1 细菌/酵母样本收集

1） 取生长到一定程度的菌液，测OD值，用培养基将各个样本的OD值调到一样，保证取样的菌体数目均一。

2）取1个15 mL离心管， 称量并记录离心管的重量a（因为步骤1中调平过，所以此处只需记录1个）。

3）取5 mL的等量菌液加到上述离心管中，离心后弃培养基，再用生理盐水或者PBS洗2-3遍，洗去残留培养基，离心去上清，保留菌体沉淀，用枪头彻底去除液体，再次称量并记录重量b，用b-a得到菌体湿重，看是否达到送样量要求，如果不够的话继续取菌液离心直到达到送样量要求。记录达到送样量要求所需要的菌液体积。

4）对剩下所有菌液样本都取上述记录的体积，离心去除培养基，生理盐水或者PBS洗2-3遍，用枪头彻底去除上清。

5）菌体沉淀连同离心管一起放进液氮中速冻，之后置于-80 ℃冰箱中保存。

2.6.2 固体真菌样本收集

1）称量固体真菌样本于离心管中，达到送样量要求。

2）菌体连同离心管一起放进液氮中速冻，之后置于-80 ℃冰箱中保存。

2.7  细胞培养液样本（研究胞外代谢物）

1）根据所培养的细胞生长特性以及研究目的，选择合适的时间点收集细胞培养液上清，2000 g，4 ℃,离心15 min去除细胞；

2）将分离出的上清液12000 g，4 ℃,离心10 min进一步去除细胞小碎片等杂质；

3）再取上清分装，进一步浓缩至500 ul-1 mL（由于上清样本代谢物浓度较低，为了保证更好地检出效果，建议浓缩送样），置于-80 ℃冰箱中保存。

2.8  其他体液类样本（唾液/鼻涕分泌物/乳汁/瘤胃液/脑脊液/灌洗液/卵泡液/痰液等）

2.8.1 唾液

1）唾液样本需在静息状态下进行收集，收集前至少2小时避免禁食禁烟禁水等（尽量不要接受外界刺激）；

2）采集前应进行漱口，除去食物残渣等杂质；

3）收集唾液样品后离心取上清液；

4）-80 ℃保存，足量干冰寄送。

2.8.2 鼻涕分泌物

1) 在鼻腔中加入无菌生理盐水约1-2 ml，刺激鼻分泌功能，10秒后收集鼻分泌物；

2) 将鼻腔灌洗液反复剧烈摇动，进行均质化处理，混合均匀；

3) -80 ℃保存，足量干冰寄送。

2.8.3 肺泡灌洗液

1）通过纤维支气管镜以无菌生理盐水或PBS灌洗4次（如果第一次灌洗的样品含血和较多杂质，则弃掉第一次灌洗液，合并收集其余3次灌洗液。如果第一次灌洗液无太多杂质，则合并收集4次灌洗液）；

2）离心10 min（4 ℃，3000 g），取上清；

3）-80℃保存，足量干冰寄送。

2.8.4 瘤胃液

1) 收集瘤胃液样本于离心管中，6000 g室温离心15 min；

2) 收集上清液，用一次性0.22 μm无菌滤膜过滤，收集滤液；

3) -80℃保存，足量干冰寄送。

2.8.5 痰液

1）采样前12 h禁食，清晨痰量多，可作为取样时间；

2）采集前应进行漱口，以除去口腔中细菌；

3）深吸气后用力咳出1-2口痰于广口无菌瓶中，痰量极少可用45 ℃ 10%氯化钠溶液雾化吸入导痰；

4）添加质量体积为0.5/1000（w/v）的叠氮化钠，用注射器将痰液来回抽提并打 出，使得痰液混匀；

5）-80℃冻存，足量干冰寄送。

2.8.6 关节液、胆汁、乳汁、脑脊液、卵泡液等

1）收集体液样本；

2）3000 rpm ，4 ℃离心15 min，取上清，分装至1.5 mL离心管中；

3）-80℃冰箱冻存，足量干冰寄送。

2.9  植物样本

2.9.1 叶片、花、茎等

1）参照实验设计采集植物叶片、花、茎、根组织后，用准备好的锡箔纸或冷冻保存管包裹样本；

2）迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min，然后放入-80 ℃冰箱冻存。

注：a.采集叶片样本时，最好在中午光照好的时间收集。b.要根据实验设计，采集样本时保持样本一致性，尤其是同一组样本（颜色、衰老程度、叶脉占比、光照、位置等）。

2.9.2 果实组织

1）对多汁的果实进行取样很难保持均一性，强烈建议将整个果实装在离心管中/自封袋中，或者先根据研究目的选择合适区域切割成“均匀”合适的小块分装至离心管中；

2）迅速用液氮速冻处理15min，再进行研磨，对粉末进行称重分装，于-80 ℃下保存。

2.9.3 根组织

1）取整株植物的根部，迅速用1×PBS漂洗掉根上的泥土；

2）用吸水纸吸掉多余水分，根据实验设计选择特定部位，分装在离心管中；

3）立即用液氮速冻处理15min，于-80 ℃下保存。

注意事项：a. 由于根部组织特别脆弱，被挤压后会变成浆糊状，所以推荐保存至离心管中，而不是锡箔纸包裹。b.植物各类组织样本建议都使用超纯水进行漂洗完之后，再研磨分装冻存，防止因种植过程中施加的一些肥料、农药等含有表面活性剂或其他杂质，对后续实验造成影响。

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