脑损伤激发的先天免疫记忆会增强心脏免疫反应，驱动炎症性心脏功能障碍

急性脑损伤可引发全身炎症反应，但脑损伤对全身免疫的慢性影响尚不清楚。同时，缺血性中风后长期继发性合并症的发病机制也有待明确。本研究旨在探讨中风后慢性系统性免疫变化及其与心脏功能障碍的关系。

德国慕尼黑大学医院中风与痴呆症研究所团队在Cell上的题为“Innate immune memory after brain injury drives inflammatory cardiac dysfunction”的研究论文。研究团队通过单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序，发现了中风后心肌细胞和单核细胞中持续的促炎变化，这些变化与心脏纤维化和舒张功能障碍有关。揭示了中风通过诱导先天免疫记忆引发多器官持续性炎症，IL-1β 介导的髓系细胞表观遗传在心脏纤维化和舒张功能障碍中起重要作用。靶向 IL-1β 或阻断单核细胞迁移可能是预防中风后心脏并发症的有效策略，为中风后免疫介导的合并症提供了新的治疗思路。

① 中风诱导全身单核细胞/巨噬细胞的长期炎症变化：对实验性缺血性中风 1 个月后的小鼠进行单细胞RNA测序，发现中风后单核细胞/巨噬细胞存在大量基因差异表达，具有促炎表型，且在心脏和肝脏中变化尤为明显。

② 中风导致慢性心脏舒张功能障碍：发现中风小鼠出现慢性舒张功能障碍，伴有心脏纤维化、细胞外基质重塑和 MMP9 活性增加等病理变化。

③ 中风促进单核细胞慢性募集到心脏：中风后心脏单核细胞/巨噬细胞的募集是一个慢性过程，且外周单核细胞对心脏纤维化有重要贡献。中风后，Ly6C^high monocytes浸润到心脏并获得组织驻留单核细胞/巨噬细胞表型，与心脏成纤维细胞相互作用，促进纤维化相关过程。

④ 中风后骨髓细胞的变化：对中风后慢性期的骨髓进行单细胞测序，发现 Ly6C^high monocytes和HSPCs存在转录变化，这些变化与炎症途径相关。移植实验证实，骨髓来源的髓系细胞变化足以驱动继发性心脏纤维化。

⑤ 中风诱导持久的先天免疫记忆：中风后的髓系细胞具有促炎活化表型且可传递给受体小鼠，导致受体小鼠心脏纤维化。这表明中风诱导的髓系细胞功能变化是持久的，且能引发远程器官的病理变化。

⑥ 先天免疫记忆的介导机制：IL-1β 在中风后训练免疫中起关键作用，通过介导表观遗传变化影响 HSPCs 和成熟单核细胞的功能。阻断 IL-1β 可预防中风后心脏功能障碍和相关病理变化。

⑦ 阻断单核细胞迁移的治疗作用：CVC治疗阻断了促炎髓系细胞向心脏的迁移，并减少单核细胞向心脏的募集，改善心脏功能，减轻心脏纤维化。这为预防中风后心脏并发症提供了一种潜在的治疗策略。

为了分析中风对全身炎症的潜在影响，对缺血性中风小鼠的血液和多个外周器官的 CD45+CD11b+ 髓系细胞进行了单细胞RNA测序（图1A）。无监督聚类后，将29,124 个髓系细胞分为了 20 个细胞簇（图 1 B）。在卒中后的晚期慢性时间点，大量基因被调节，尤其是在单核细胞/巨噬细胞群中，而其他细胞群（包括中性粒细胞或树突状细胞）受到的影响较小（图 1 C）。中风后Ly6C^high monocytes细胞中炎症信号通路显著上调，包括参与趋化和细胞粘附（Cx3cr1、Lyz2、Icam1 和 Itga4）、细胞因子和 IFN 介导的信号通路（Csf1r、Cebpa、Itgb2、Il10ra、Aim2、Irf8 和 Irf5）以及PRR（Irak2 和 Tab2）（图 1 D）。

在各个器官中，心脏和肝脏中单核细胞/巨噬细胞群的变化尤为明显（图 1 E）。在中风后 1 个月的心脏中发现了Ly6C^high monocytes细胞群的选择性变化（图 1 F-G），这改变了单核细胞向心脏巨噬细胞的分化轨迹。将该群体称为“中风后单核细胞/巨噬细胞”（图 1 H）。此外，中风后心脏Ly6C^high monocytes细胞群表现出与组织驻留相关的基因表达增加。这些结果表明，中风会促进Ly6C^high monocytes细胞群向心脏募集，可能会进一步分化为组织驻留巨噬细胞。

图1 中风诱发全身单核细胞/巨噬细胞的长期炎症变化

通过多普勒超声心动图等技术，研究发现中风小鼠出现慢性舒张功能障碍，伴有心脏纤维化、细胞外基质重塑和MMP9活性增加等病理变化（图 2 A-F）。通过smFISH检测到心脏巨噬细胞中MMP9显著增加，这很可能是心脏 MMP9 表达增加的原因（图 2 G）。通过流式观察到卒中后心脏中Ly6C^high monocytes和CCR2^high monocytes/macrophages细胞数量增加（图 2 H）。这些结果表明卒中后单核细胞的浸润增加，单核细胞向巨噬细胞的分化逐渐增强。

图 2 中风导致慢性心脏舒张功能障碍和炎症性心脏重塑

接下来，对三名代表性中风患者是否出现了中风后慢性心脏功能障碍进行了分析，并在发病后 3 个月和 6 个月进行随访（图 3 A）。从中风后 1-3 个月死亡的患者中获取了心肌尸检样本，观察到中风患者左心室壁中 ECM 沉积显著增加（图 3 B-D）。中风后心脏中 CCR2 ⁺单核细胞数显著增加，中风后心脏巨噬细胞中MMP9上调表达（图 3 E-H）。最后，进行了bulk RNA测序，发现中风患者中上调基因与 ECM 重塑有关，包括PON1和KRTCAP2（图 3 I 和 3J）。综上所述，观察到小鼠和中风患者均出现了明显的心脏纤维化和 ECM 重塑，这进一步证实与中风后的舒张功能障碍有关。

图 3 中风增加患者心脏纤维化和单核细胞的积聚

使用Ms4a3 ^creERT2-Ai14小鼠品系，观察到心脏单核细胞/巨噬细胞的细胞募集不仅是对中风的急性反应，而且会随着时间的推移而持续存在，作为一种慢性长期结果 (图 4 A)。此外，观察到超过 95% 的心脏髓系细胞在中风后 1 个月内被替换，强调了浸润单核细胞在影响中风后心脏功能方面的重要性 (图 4 B)。

进一步使用Ccr2 ^creERT2-Ai14小鼠品系，研究外周单核细胞对心脏纤维化的贡献(图 4 C)。通过单细胞测序分析了中风后 1 个月的小鼠心脏间质细胞。鉴定出 20 个细胞簇，并确定了 7 种不同的心脏单核细胞和巨噬细胞(图 4 D)。Ccr2-tdTomato (tdT) 表达在 4 种单核细胞/巨噬细胞亚群中特异性富集 (图 4 E 和 4F)。轨迹分析进一步发现，即Ly6C^high monocytes渗入心脏并获得组织驻留单核细胞/巨噬细胞表型 (图 4 G 和 4H)。使用 CellChat 对 tdT ⁺细胞亚群（作为来源）和心脏成纤维细胞（作为靶细胞）进行了细胞间相互作用分析，发现大量上调的相互作用（而没有下调）与组织纤维化和炎症过程有关（图 4 J）。此外，使用原位smFISH检测到波形蛋白阳性成纤维细胞显著增加（图 4 K）。

图 4 中风促使慢性单核细胞募集到心脏

为了探索卒中后免疫介导的心脏功能障碍的潜在机制，对卒中后慢性期的骨髓 (BM) 髓系区室进行了深入分析。通过单细胞RNA测序分析了卒中对 BM 的长期影响。确定了 21 个细胞簇以及从造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 到所有其他成熟髓系群体的分化轨迹，并在卒中后慢性期发现了 Ly6C^high monocytes独特的转录组特征（图 5 A-C）。

为了测试中风后骨髓变化的持久性和潜在作用，采用BM 耗竭模型（用poly(I:C) 处理 Mx1 ^Cre:c-myb^fl/fl小鼠）（图 5 F）。移植 1 个月后，分离了 GFP ⁺移植的髓系细胞进行单细胞 RNA 测序，证实所有动物均成功进行了 BM 植入（图 5 G）。有趣的是，差异比较发现中风后移植细胞的表型高度保守，中风小鼠的 BM 细胞和移植了中风 BM 细胞的受体小鼠的 BM 细胞均保留了促炎激活表型（图 5 H）。证实了髓系细胞在中风后获得了可通过 BM 移植传递的独特促炎表型。

对来自血液和心脏的组合数据集进行轨迹分析，观察到中风后血液单核细胞到心脏单核细胞/巨噬细胞的分化轨迹发生了转变 (图 5 I-J)。此外，发现BM移植的 GFP +心脏单核细胞/巨噬细胞中Mmp9表达增加，心脏纤维化显著增加（图 5K-M）。总之，这些发现表明，髓系功能不仅在中风后发生稳定改变，而且髓系区室的这些变化足以驱动继发性心脏纤维化。

图 5 中风诱发持久的先天免疫记忆

在接种疫苗后和感染模型中，出现了一种被称为训练免疫的现象，通常表现出先天免疫细胞对后续刺激的反应增强。事实上，观察到从中风小鼠中分离出的原代单核细胞以及 BM 衍生的巨噬细胞的吞噬活性增加，总体上证实了中风导致的训练免疫（图 6 A）。训练免疫的一个特征是髓系细胞的表观遗传重编程。因此接下来分析转录因子 (TF) 是否参与了 HSPC 和单核细胞中的表观遗传重编程。发现HSPC 中有几种 TF 基序的差异富集，包括 CTCF、STAT1/2、GABPA、CEBPD、GFI 和 KLF14（图 6 B）。与 HSPC 中的发现一致，发现中风后单核细胞中的 H3K4me3 水平与各种 TF 基序紧密相关，包括 CTCF 和与 NF-κb 和 IL-1 信号通路和促炎反应相关的几个区域，如 E2F2、ATF7、STAT1 和 KLF14（图 6 C）。

前期研究发现中风在内的组织损伤会导致全身性炎症小体激活和IL-1β 分泌，血清 IL-1β 浓度在损伤后的最初几个小时内达到峰值。此外，感染模型研究也表明 IL-1β 介导参与了表观重编程。因此，对中风后 1 个月接受IL-1b neutralizing antibodies治疗的动物进行了scATAC-seq。共鉴定了11 个细胞群，并确定了中风中TF 基序的显著变化（图 6 D-E）。证实了中风会显著改变造血干细胞 (HSC) 中TF 的活性，如 CTCF、ETV4 和 RUNX2。证实了通过改变与应激和免疫反应相关的 TF基序进而改变了Ly6C^high monocytes的表观遗传，如 CTCF、NFE2和 FOS:JUND(AP1)。重要的是，IL-1β治疗可阻止中风引起的 HSPC和Ly6C^high monocytes中大部分染色质可及性变化（图 6E)。最后，为了证实 IL-1β 驱动中风后的表观遗传重编程，使用IL-1β 处理富含 HSPC 的骨髓 BM，并进行bulk ATAC-seq。发现了IL-1β 处理引起了染色质可及性的显著改变（图 6 F）。总之，这些结果证明了 IL-1β 在诱导表观遗传变化导致中风后训练免疫方面的关键作用。

图 6 先天免疫记忆由卒中后早期 IL-1β 分泌介导

进一步探究了IL-1β 在卒中后增加骨髓生成和单核细胞募集到心脏中的作用。在未发生卒中的小鼠中注射IIL-1β 1 周后评估心脏和 BM 骨髓的细胞组成 (图 7 A)。观察到IL-1β 治疗的小鼠心脏中Ly6C^high monocytes和CCR2^high monocytes/macrophages的细胞数显著增加，并发现HSPC的增加 (图 7 B-C)。值得注意的是，观察到接受αIL-1β处理后，可显著降低中风后的 Ly6C^high monocytes和CCR2^high monocytes/macrophages细胞数（图 7 F-G）。这些发现表明，IL-1β 驱动的表观遗传变化导致的训练免疫，可能与中风后的慢性心脏纤维化有因果关系。

尽管IL-1β 对先天免疫记忆和心脏继发性合并症具有显著疗效，但由于感染风险增加，其在卒中患者中的转化应用受到限制。因此寻求替代方案，使用CVC来阻断促炎性髓样细胞向次级器官的迁移。发现CVC 治疗可显著减少单核细胞向心脏的募集（图 7 J-K）。重要的是，CVC 治疗减少了炎症性心脏 ECM 重塑，也显著改善了中风后慢性期的舒张性心脏功能（图 7 N）。总之，这些结果证明了阻断促炎性程序化单核细胞从骨髓到心脏的迁移，可作为预防中风后继发性心脏合并症的一种策略的治疗潜力。

图 7 IL-1β驱动的先天免疫记忆介导中风后心脏功能障碍

原文链接：http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00702-5